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详细信息

透射电镜常温超薄切片制备方法
1、取材及固定:
组织样本:样品尺寸要求1~2mm3左右,加入2.5%戊二醛,于4度保存。对于某些特定形态的组织样品(如肠道等),取材时至少保证组织块一个面的厚度为1mm,对有切片方向要求的组织样品,还需标识切片横纵轴方向。
细胞/细菌样本:细胞团要求至少半个绿豆大小。悬浮培养细胞/细菌,离心收集,弃去培养液,加入2.5%戊二醛,用牙签拨散细胞团,于4度保存。对于贴壁细胞,先倒去培养液,加入2.5%戊二醛,4度固定15分钟,用细胞刮刮下,离心收集(固定液保留),于4度保存。
固定时间:至少4个小时。
2、饿酸固定
将用戊二醛固定的细胞或组织,经0.1 M磷酸缓冲液(PH7.2)漂洗3次,每次15分钟,再用1%的饿酸•0.1 M磷酸缓冲液(PH7.2)室温(20℃)固定2小时(固定时间因样品不同而适当调整)。然后再经0.1 M磷酸缓冲液(PH7.2)漂洗3次,每次15分钟。
3、脱水
样品脱水经30%、50%、70%、80%、85%、90%、95%、100%(两次)酒精梯度脱水,每次15~20min(含水量多、细胞膜厚的样品可适当延长脱水时间)。
4、渗透
渗透剂依次为丙酮:环氧树脂(2:1)、丙酮:环氧树脂(1:1)、环氧树脂,37度温箱内,每次渗透8~12h。
5、包埋
将渗透好的样品放入胶囊或包埋板中,加入包埋剂环氧树脂,在60度温箱中聚合48h。
6、超薄切片
切片厚度:80~100 nm。
7、双染色
铀铅双染色(2%醋酸铀饱和水溶液,枸橼酸铅,室温染色15min),切片室温干燥过夜,电镜观察。
电镜型号:TEMHitachiHT7700产地Japan
超薄切片机:Leica(德国)型号:EM UC7
2020年3月10日
Zheng


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